Según la bula papal, los residentes podían abandonar el gueto solo durante el día, luego, desde el atardecer hasta el siguiente amanecer, las tres entradas al vecindario estaban cerradas por medio de grandes puertas, y cualquiera que se hubiera demorado y permaneciera afuera más allá del el tiempo permitido habría tratado con la implacable justicia papal.
Además de la obligación de residir dentro del ghetto, los judíos tenían que usar, cuando se fueron, una insignia que los haría siempre reconocibles (era un trozo de tela o un velo azul llamado glaucus en la burbuja de 1555) y estaba prohibido por ellos para poseer bienes inmuebles. Las casas donde vivían fueron alquiladas por propietarios no judíos, quienes las alquilaron a miembros de la comunidad a precios establecidos por una ley, llamada Ius Gazzagà, que disponía que la renta, una vez establecida, permanecería cerrada a perpetuidad.
Esta última prohibición condujo a una disminución en el cuidado de las propiedades en sí y, por esta razón, las casas en el ghetto fueron particularmente degradadas, lo que justificó al gobierno italiano recién instalado, con motivo de la construcción de las paredes, para autorizar su destrucción.
En 1888, con la implementación del nuevo plan maestro de la capital, se demolieron la mayoría de las calles antiguas y edificios antiguos, insalubres y sin baños, creando así tres calles nuevas: via del Portico d'Ottavia (que tomó el lugar de la antigua vía della Pescheria), vía Catalana y vía del Tempio. De esta manera, pequeñas cuadras y calles enteras que constituían el antiguo tejido urbano del distrito han desaparecido. Para tener una idea de cómo debería haber sido el antiguo gueto, solo mira la hilera de edificios al costado de via del Portico d'Ottavia.
En 1889 se lanzó un concurso para la construcción de la nueva sinagoga y, en 1897, la Comunidad Judía compró el área entre Lungotevere Cenci y vía del Portico d'Ottavia del Municipio de Roma, liberada de las demoliciones anteriores. Así, en 1901 comenzaron las obras que finalizaron en 1904 y el 29 de julio de ese año se inauguró el Tempio Maggiore en Roma. El Museo Judío ha encontrado recientemente alojamiento en el sótano del edificio.

En el período nazi-fascista
El sábado 16 de octubre de 1943, los nazis llevaron a cabo una redada que , aunque afectó a muchas otras áreas de Roma, tuvo su epicentro en el antiguo ghetto, donde fueron capturados más de mil judíos. Después de haber rodeado el vecindario a la primera luz del día, secciones de las SS secuestraron a numerosas personas, especialmente en via del Portico d ' Octavia Desde uno de los dos edificios renacentistas en la calle, ubicado en el número 13, llamado "il portonaccio" por los lugareños, muchas de las personas fueron deportadas y luego deportadas.
 Los prisioneros fueron encerrados en el Colegio Militar del Palazzo Salviati en via della Lungara. Transferidos a la estación de ferrocarril de Tiburtina, fueron cargados en un convoy que consta de dieciocho vagones de ganado. El convoy, que partió el 18 de octubre, llegó al campo de concentración de Auschwitz el 22 siguiente. Solo diecisiete deportados sobrevivirán, entre ellos solo una mujer y ningún niño.